NGS（次世代定序）簡介
NGS(Next Generation Sequencing, NGS)，又稱為第二代定序或基因高通量分析，以第一代定序方法為基礎而開發出的新技術。因第一代定序方法通量低、成本高與耗時長，對大規模之應用造成影響，因此有NGS技術的發展。NGS降低單一鹼基定序所需的成本，也讓當前的定序檢測不再受限於基因的大小或多寡。因此，NGS近年來在臨床上被廣泛地應用，包含偵測血液中游離的DNA，以做為腫瘤基因突變的檢測方法，以及孕婦產前遺傳篩檢的診斷技術，加速了精準醫學的實現。
隨著次世代定序技術的問世，大幅縮短了相關研究的解序時間，同時拓展了基因體研究的廣度與深度，亦可應用於臨床診斷上，目前已有儀器與試劑通過美國FDA認證。
基本原理及操作流程
NGS 定序平台之基本原理及操作流程，主要可分為樣本庫製備(library preparation)、樣本庫擴增(library amplification)、定序反應(sequencing reaction)及數據分析(data analysis)等四大步驟。
1. 樣本庫製備(library preparation)
將待測之樣品經核酸萃取後，利用物理性方法（如超音波震盪法）或酵素裁切等方式，將基因序列進行核酸片斷化(fragmentation)，再將其末端接上轉接子(adaptor)，以作為樣品庫。
2. 樣本庫擴增(library amplification)
藉由基因片段上的轉接子會與微磁珠(micro-beads)或晶片上的互補序列相結合，而固定於固相介質上，進行乳化聚合酶鏈鎖反應(emulsion PCR)或橋式聚合酶鏈鎖反應(bridge PCR)。乳化聚合酶鏈鎖反應係指欲放大之模板 DNA 均勻分散至油滴中，每個油滴中含有球狀微粒，藉由球狀微粒中的引子及聚合酶酵素及試劑進行聚合反應。而橋式聚合酶連鎖反應藉由將擴增之 DNA 片段聚集於晶片表面，以快速擴增單一DNA片段。
3. 定序反應(sequencing reaction)
次世代定序法依不同的定序平台，而有不同的定序原理。Roche 454 定序平台是透過焦磷酸定序法(pyrosequencing)來定序的，過程中依序置入帶有 4 個不同鹼基的去氧核苷酸，當核酸聚合酶將去氧核苷酸接合時，釋出焦磷酸根離子(pyrophosphate)，釋出的焦磷酸根因 ATP 硫酸酶(ATP sulfurylase)轉換產生ATP，再藉由冷光酶(luciferase)接收 ATP 能量將冷光素(luciferin)進行氧化，最後由感測器測得訊號，透過反覆的試劑置換與偵測，得到大量定序的結果。
4. 數據分析(data analysis)
將定序後的大量資訊與現有的資料庫進行比對(mapping)及計數(counting)分析，設法還原原始待測基因片段序列。
次世代定序技術用於疾病治療
次世代定序技術對兒童的遺傳疾病診斷，目前已有優異的表現。相關研究資料顯示，相較於傳統使用染色體晶片分析和選擇性定序只能獲得13%的正確率，全基因體定序可獲得高達34%的正確診斷。而在罕見疾病中，有80%屬於遺傳性疾病，次世代定序技術的應用更有其不可或缺的重要性。
但是，診斷疾病的次世代定序資料分析並非易事。研究數據顯示，將99個遺傳性疾病交給9個分子診斷實驗室進行分析，只有33個病例能獲得一致的診斷；即使經過重複的討論，也只有71%病例能獲得一致的診斷。雖然已得知病人的DNA序列，但每一個基因體都帶著太多的序列差異（DNA突變），導致要診斷出一致的疾病仍然非常困難。
次世代定序技術對癌症治療成果上，除卻小細胞肺癌、大腸直腸癌，乳癌，卵巢癌，黑色素瘤，及慢性骨髓性白血病，在其他方面已有具體成效。但因腫瘤基因發生變異的程度有極大且複雜的變化，光靠單一藥物就立見療效的機會有限。未來大多數癌症治療仍須整合基因檢測、新治療策略或藥物的發展、及前瞻性臨床試驗以獲得較有說服力的證據來提升精準醫學對癌症治療的效能。人類不可因目前的成效無法擴及大多數癌症患者，或是單就成本效益的問題，而放棄人類於癌症治療邁向進步的動力。因為癌病對各種治療的反應差異大，多數的醫師還是認為精準醫學對癌症治療是必然該走的有效路徑。
加州聖地牙哥大學的 Maria Schwaederle等人，整合分析了346個第一期癌症治療臨床試驗 (phase I clinical trials)，涵蓋個案數高達13,203人。研究中比較：58個精準醫學實驗組 （包含2,655病患），和未使用精準醫學策略的293個對照組（包含10,548病患）。使用精準醫學策略意即：使用腫瘤特異生物標記來選擇藥物；治療效果的指標包括：藥物反應率 (response rate, RR)、無惡化存活率 (progression-free survival, PFS)。從這二種預後指標，都顯示精準醫學策略的癌症治療能獲得顯著的優秀效果。這個整合研究的資料也顯示：大部分的第一期癌症治療臨床實驗，現階段尚未使用精準醫學策略。使用精準醫學策略，應該是日後的各期臨床試驗都應檢驗的方向。
次世代定序之相關法規
基於多個國家推動精準醫療或基因體計畫以及基因定序的價格越來越低，龐大基因數據資料庫中一個很重要的用途，是為便於後續定序的突變基因位點分析與比對，而這段需要生物資訊協助的應用與需求，卻仍沒有公認的標準，大多參照學術研究的方法來進行分析，在臨床應用時，判讀責任則由醫師承擔。
自 2016 年起 ，FDA 就嘗試針對 NGS 後端數據分析應用，舉行多場公相關之聽會及研討會，試圖就法規科學的監管角度，擬定對產業有所助益的監管條例。FDA 在最新公告的產業指引中，包含將針對基因變異資料庫的運用，提出新的措施：
FDA 正嘗試建立 NGS 檢測結果的分析標準，針對以 NGS 技術為基礎的體外診斷（IVD）產品、服務、設計、開發與分析驗證，提供驗證 NGS 檢測的建議；同時鼓勵廠商積極參與標準制定組織，以加速制定出 NGS 臨床應用的相關標準。
FDA 藉由與 NIH 合作，建立高品質的公開基因變異資料庫，以提供公開並具有公信力的基因資料庫，並允許產業使用來自 FDA 認可的基因變異公共資料庫，以測試產品的臨床有效性。
此外，FDA 創建了 precisionFDA 網路雲端平台，這是一個建置於雲端的生物資訊研究及新分析方法開發的入口網站，主要在吸引全球各地的分析方法及分析工具在這網站上共享，以測試、驗證 NGS 現有生物資訊分析方法。
隨著NGS的伴隨式診斷產品陸續獲得US FDA及CFDA許可，意味著NGS基因檢測產業有了新的商業模式。藉由與臨床診斷緊密相關的優勢，除了能提供醫生更精準的藥物決策資訊外，又能建立合理的醫療保險給付機制，擴大使用族群；在累積大量基因數據後，更能增加與國際藥廠合作、進行新藥開發的機會。
次世代定序於台灣之發展
台灣進行癌症基因突變組合（Gene Panel）的臨床研究與開發，主要以教學醫院為臨床研究核心，其中又以台灣大學醫學院、台北醫學大學、長庚醫學大學及中國醫藥大學最為積極。針對此領域投入研發的國內廠商主要有：行動基因、慧智基因、麗寶生醫、威健生技、有勁生技。
台灣臨床環境健全、醫療資料豐富，分子診斷人才亦充足，適合針對NGS臨床應用產品進行開發與驗證。至於明確的法規，例如：醫療器材上市審核、實驗室規範及病歷資料使用辦法，以及保險給付條件的確立等等，各項與臨床醫療服務相關的重要法規，都是推進NGS臨床醫療檢測產業發展最重要的關鍵因素，需要相關單位（衛福部）於盡快提出管理辦法，以促進台灣基因檢測產業的發展。
參考資料：
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